Investigación básica en patología cerebrovascular. ¿Por dónde vamos?

Investigación básica en patología cerebrovascular. ¿Por dónde vamos?

M. Blanco, M. Rodríguez-Yáñez, R. Leira, J. Castillo

En las últimas décadas se han hecho grandes avances tanto en la prevención como el diagnóstico y el tratamiento del ictus1,2. Al mismo tiempo, y gracias a los modelos animales, el conocimiento de los mecanismos fisiopatológicos implicados en la isquemia cerebral ha avanzado muy notablemente3,4. Además estos modelos han permitido localizar numerosas dianas terapéuticas5,6; sin embargo, el fracaso de los tratamientos neuroprotectores en clínica humana ha conducido a un gran debate sobre la utilidad de los modelos animales en esta compleja enfermedad7,8. El por qué de la pérdida de eficacia en la investigación traslacional entre el modelo animal y el humano ha sido discutido en numerosos trabajos, encontrando importantes deficiencias en los modelos experimentales9-12. Eso ha llevado en el último año establecer recomendaciones sobre cómo adaptar la investigación básica en la patología vascular cerebral para que se adecue lo más posible a la clínica humana13.

Recientemente han sido publicadas las prioridades en la investigación sobre ictus para el próximo decenio14 por un grupo de expertos reunidos en Bruselas con objeto de establecer las líneas de investigación que abordarán las necesidades científicas, clínicas e industriales más perentorias en materia de ictus. En dicha guía se establecen una serie de prioridades dirigidas a la investigación en biología cerebrovascular:

  • Investigar la biología molecular y celular de la barrea hematoencefálica (BHE) para aprender a regular sus características en el endotelio del SNC como requisito para entender la fisiopatología de la microcirculación del SNC durante la fase aguda del ictus.
  • Comprender los mecanismos celulares y moleculares con los que las células endoteliales de la BHE reaccionan a la isquemia cerebral focal e identificar los objetivos para proteger estas células, la BHE y la unidad neurovascular frente a la isquemia. Definir los marcadores de la alteración de la BHE y los que puedan predecir la hemorragia inducida por trombolíticos.
  • Conocer la secuencia de las señales del tráfico molecular implicadas en el reclutamiento de leucocitos a través de la BHE con el fin de prevenir específicamente la migración de leucocitos patógenos en el SNC, manteniendo al mismo tiempo la selección de posibles células reparadoras.
  • Conocer y actuar sobre la angiogénesis, la vasculogénesis y la arteriogénesis antes o después de un ictus. Estudiar la interacción de la angiogénesis y la neurogénesis.
  • Desarrollar modelos en animales pequeños para el ictus lacunar. Investigar mecanismos lesionales en la medida en que se relacionen con la oclusión de vasos de pequeño tamaño.

Basándonos en estas líneas generales repasaremos los últimos avances en la biología molecular de la isquemia aguda, la biología molecular de la recuperación cerebral tras el ictus, la biología molecular del precondicionamiento isquémico y, por último, los avances en la genómica de la enfermedad vascular cerebral.

En la última década se ha producido un gran número de trabajos de investigación básica que han profundizado en el conocimiento de la biología molecular de la cascada isquémica (fig. 1). Dentro de ella se pueden destacar tres aspectos fundamentales: laexcitotoxicidad inducida por la isquemia, la inflamación originada en la fase aguda de la isquemia y el concepto de “unidad neurovascular”.

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Excitotoxicidad inducida por la isquemia

Está ampliamente aceptado que el factor crítico determinante de la muerte neuronal durante la isquemia cerebral es la progresiva acumulación de sodio y calcio intra

celular, que es capaz de inducir muerte neuronal por necrosis o apoptosis en neuronas vulnerables. Altas concentraciones de sodio intracelular inducen el edema citotóxico y la desorganización microtubular, fenómenos que conducen a la necrosis celular15. Cambios en los niveles citoplasmáticos de calcio van a poner en marcha diversas cascadas intracelulares como el estrés oxidativo o nitrosativo, la disfunción mitocondrial o la activación de proteasas que van a llevar al daño neuronal. Desde que Olney16 postuló el efecto neurotóxico del glutamato, numerosos trabajos han demostrado cómo durante las primeras fases de la isquemia se va a producir una entrada masiva de calcio y sodio en el interior neuronal a través de los receptores glutamatérgicos; esto es lo que se ha venido a llamar el paradigma de la excitotoxicidad mediada por glutamato17. Sin embargo, en los últimos años está siendo objeto de numerosas críticas, ya que a pesar de que los antagonistas de los receptores de glutamato de primera, segunda y tercera generación han demostrado buenos resultados en los modelos de isquemia cerebral animal han fallado en la neuroprotección en humanos18. En los tres últimos años, algunos experimentos básicos han cambiado las ideas sobre el paradigma neuroexcitatorio. Estos trabajos han demostrado la existencia de nuevas proteínas membrana-plasmáticas encargadas en la homeostasis del calcio y del sodio directamente implicadas en la isquemia cerebral19- 21. Dichas proteínas pueden ser las responsables del mecanismo de muerte celular mediado por calcio durante la isquemia cerebral, estableciéndose una nueva teoría neurotóxica noglutamatérgica22.

Inflamación en la isquemia aguda

“Inflamación” es un término que engloba un complejo proceso en el que están imbricados mecanismos celulares, hormonales y bioquímicos, sistémicos y organoespecíficos. Existe una numerosa evidencia experimental que apoya el papel de la inflamación, la inmunidad innata y la inmunidad adaptativa en la enfermedad vascular cebrebral23. Un objetivo de numerosos trabajos de investigación ha sido la búsqueda de marcadores inflamatorios que predigan la aparición de un ictus o el pronóstico en el caso de que se produzca (tabla I). En los últimos años han sido descritos otros marcadores en relación con la isquemia cerebral. La PARK7 es una chaperona activada por el estrés oxidativo que se eleva en plasma en los primeras tres horas tras el ictus y que tiene una sensibilidad diagnóstica entre el 54% y el 91% y una especificidad del 80-97%24. La nucleosida difosfatocinasa A (NDKA) es una proteína similar con una sensibilidad entre el 70% y el 90% y una especificidad entre el 90%- 97%24. La adiponectina es una adipocitocina con actividad antiinflamatoria y antiaterogénica que se correlaciona de forma inversa con el volumen del infarto y el pronóstico en pacientes con ictus isquémico25. Los niveles plasmáticos de los ligandos endógenos de los receptores PPARg (15-dPGJ2) muestran una importante actividad antiinflamatoria26 y se han asociado como marcadores independientes de pronóstico en la fase aguda del ictus, y con menor volumen del infarto27. Dichos receptores PPARg son estimulados exógenamente por fármacos como las estatinas que han demostrado un papel importante en la fase aguda del ictus28.

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Unidad neurovascular

La unidad neurovascular (UNV) es un nuevo concepto que engloba una estructura anatomico funcional formada por la célula endotelial de los vasos intracraneales, el astrocito y la neurona. Las interacciones célula-célula o célula-matriz extracelular durante la fase aguda de la isquemia cerebral son objeto de numerosos trabajos de investigación en los últimos años. La disfunción de la UNV después del ictus va a ser la responsable de la disrupción de la barrera hematoencefálica, condicionando el edema cerebral o la transformación hemorrágica29 así como la amplificación de la respuesta inflamatoria en el ictus agudo30. La pérdida de homeostasis entre las células y la matriz extracelular de la UNV va a iniciar múltiples cascadas bioquímicas que van a condicionar la muerte celular29.

Las proteasas de la matriz extracelular son un grupo de enzimas responsables de la alteración de la homeostasis de la UNV tras ser activadas en la isquemia cerebral. El papel de las metaloproteasas (MMP) y el activador del plasminógeno en la isquemia aguda han sido ampliamente estudiados en los últimos diez años. Las MMP comprenden una familia de zinc-endopeptidasas capaces de degradar los elementos esenciales de la matriz extracelular del SNC31. Su papel en el infarto cerebral dual; por un lado, en la fase aguda del ictus las MMP van a mediar en el daño tisular a través de la rotura de la barrera hematoencefálica causando la muerte celular. También desempeñan un papel muy importante en la complicaciones derivadas del tratamiento fibrinolítico32. Por otro lado en fases más evolucionadas del infarto cerebral van a tener un papel muy importante en las tareas de recuperación cerebral. Las MMP van a degradar y eliminar diferentes sustratos de la matriz extracelular y promover la liberación de factores de crecimiento y señalizaciones para células madres que van a ser las responsables del proceso de neurorreparación33 (fig. 2). Además de los moduladores de la homeostasis de la matriz extracelular, cada vez son más los trabajos experimentales que destacan la importancia de la comunicación entre las células endoteliales activadas y la microglía desempeñando una función en la activación de vías apoptóticas durante la fase aguda y de antiapoptóticas durante la reparación neuronal34.

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BIOLOGÍA MOLECULAR DE LA REPARACIÓN CEREBRAL

Aquellos pacientes que consiguen sobrevivir a un ictus en su fase aguda y son Tabla I Marcadores inflamatorios implicados en el ictus isquémico Marcadores inflamatorios – Proteína C reactiva ultrasensible (PCR us) – Fibrinógeno – Amiloide sérico A – Metaloproteinasa de matriz 9 (MMP9) – Selectina P – Fracción soluble del CD40 ligando – Mieloperoxidasas – Molécula de adhesión vesicular 1 (BCAM-1) – Molécula de adhesión intracelular 1 (ICAM-1) – Factor de necrosis tumoral alfa (TND-a) – Interleucinas 1, 6 y 8 (IL-1, IL-6 e IL-8). dados de alta van entrar en la fase crónica de la enfermedad. En esta fase van a experimentar una lenta mejoría que se desarrollará a lo largo de las primeras semanas o incluso meses. Este periodo activo es conocido como neurorreparación y hasta el momento conocemos poco del mecanismo implicado en el mismo (fig. 3). El fundamento terapéutico de la neurorreparación se basa en la reconstrucción parcial del tejido dañado, potenciando mecanismos celulares endógenos (neurogénesis y angiogénesis) a través del aporte de células exógenas (trasplante celular)35.

Neurogénesis y angiogénesis

En modelos animales se ha observado que, tras el daño cerebral producido por la isquemia, se va a producir un incremento en la expresión de genes que se expresan habitualmente en fases de embriogénesis o desarrollo cerebral36 (fig. 4). Estas observaciones sugieren que existe un mecanismo activo neurorreparador. Numerosos trabajos experimentales han confirmado la aparición de neurogénesis en tejido cerebral adulto en áreas periventriculares y en la zona del girus dentado37-42. Por otro lado, la formación de nuevos vasos sanguíneos, angiogénesis, es muy prominente en el área periinfarto43-45. Tanto la angiogénesis como la neurogénesis desarrollada tras el infarto cerebral van a crear un medio dentro del área necrótica que va a ser responsable en gran medida de la mejoría funcional de los pacientes en la fase crónica46,47. La investigación en neurorreparación abre una línea terapéutica nueva coincidiendo con la decepción que ha mostrado la terapia neuroprotectora en los últimos años. Un conocimiento de los mecanismos que subyacen a la neurorreparación ha abierto una línea prioritaria de investigación y terapéutica para los próximos años48.

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AVANCES EN INVESTIGACIÓN GENÉTICA

Los estudios realizados en gemelos, familias y modelos animales han proporcionado la evidencia suficiente de que el ictus tiene un componente genético, aunque el alcance de dicho componente es incierto. En los primeros estudios realizados en gemelos se encontró que los monocigóticos presentaban un mayor riesgo de ictus que los dicigóticos49. También se ha encontrado en estudios de casos y controles que la historia familiar incrementa el riesgo de ictus en un 75%50. Sin embargo, la predisposición genética del ictus varía dependiendo de la edad y del subtipo de ictus. El componente genético es más intenso en los pacientes menores de 70 años51,52 y en los de pequeño y gran vaso que en los criptogénicos y cardioembólicos51-53.

Pero además de los estudios de asociaciones existen casos concretos de ictus que siguen un patrón de herencia mendeliana, como la arteriopatía autosómica dominante, con infartos subcorticales y leucoencefalopatía (CADASIL), en la que se ha identificado como responsable el gen NOTCH3, localizado en el cromosoma 1954, o la citopatía mitocondrial, caracterizada por encefalopatía con episodios similares a ictus y acidosis láctica (MELAS), en la que se ha encontrado una mutación en el ADN mitocondrial55. Incluso hay algunas enfermedades genéticas que cursan con alteraciones del tejido conjuntivo en las que existe un riesgo mayor de ictus debido a disecciones arteriales, como el síndrome de Marfan56 o la enfermedad de Fabry57.

Los diversos factores genéticos del ictus pueden actuar de diferentes maneras. Pueden contribuir al desarrollo de factores de riesgo como la hipertensión, la diabetes o la hiperhomocisteinemia, interaccionar con factores ambientales o contribuir directamente sobre fenotipos intermediarios, como la aterosclerosis. Los factores genéticos también pueden afectar a la latencia del ictus, al tamaño del infarto y al pronóstico funcional.

El sistema renina-angiotensina-aldosterona ejerce un efecto sobre la presión arterial sistólica. Existen evidencias de que variaciones genéticas en este sistema contribuyen al riesgo de ictus. El principal gen estudiado es el del la enzima convertidora de angiotensina. La enzima convertidor de angiotensina ejerce su efecto actuando sobre el tono vascular, la función endotelial y la proliferación de las células musculares lisas. Se ha relacionado el polimorfismo inserción/ delección (I/D) del gen de la enzima convertidora de angiotensina con un riesgo mas elevado de cardiopatía cisquémica58 y de ictus59,60. En un metaanálisis se encuentra que el genotipo D/D se relaciona con un incremento leve del riesgo de ictus61; sin embargo, estudios posteriores no encuentran dicha asociación62,63. Ningún estudio ha encontrado un incremento del riesgo superior al 20%, lo que sugiere que el alelo D ejerce un efecto discreto en el riesgo de ictus.

Otros factores relacionados con la función endotelial que han sido objeto de estudio son los genes codificantes de la óxido nítrico sintasa endotelial (eNOS). Los estudios realizados son contradictorios, ya que algunos autores han encontrado una asociación entre el polimorfismo Glu298Asp de la eNOS y un mayor riesgo de fenómenos isquémicos64, aunque otros no han encontrado dicha asociación65. También se ha visto que los ratones deficientes en eNOS son más sensibles a la isquemia cerebral focal66.

Los defectos genéticos en el metabolismo de la homocisteína pueden conducir a una hiperhomocisteinemia importante y a la aterosclerosis, por lo que ha sido un gen de interés. La variante genética C677T de la metilen tetrahidrofolato reductasa, una enzima importante en el metabolismo de la homocisteína, ha sido relacionada con el ictus isquémico. El genotipo TT, presente en el 10% de la población, incrementa la dosis total de homocisteína en un 20% y aumenta el riesgo de ictus en relación con el genotipo CC67,68. Se han propuesto numerosos genes relacionados con la hemostasia y la trombosis como posible causa de ictus. Debido a que los niveles elevados de fibrinógeno relacionan la aterosclerosis y mecanismos protrombóticos, éste ha sido un candidato importante en la búsqueda de factores genéticos. El genotipo homocigótico AA del polimorfismo G-A 455 del gen del fibrinógeno produce unos niveles más elevados de fibrinógeno y se ha encontrado una mayor prevalencia en los casos de ictus de gran vaso22. También se ha encontrado que la variante PIA2 en el receptor plaquetario del fibrinógeno es un factor de riesgo de ictus importante en pacientes menores de 50 años69. Los estudios relacionados con la aterosclerosis han tenido gran importancia en la búsqueda de genes relacionados con el ictus. La fosfodiesterasa 4D (PDE4D) degrada selectivamente el AMP cíclico reduciendo sus niveles, lo que se asocia con un incremento de la proliferación y migración de las células musculares lisas, lo cual se ha relacionado con la aterosclerosis. Se han relacionado los polimorfismos en la PDE4D con un mayor riesgo de ictus de gran vaso y cardioembólico70. Otro gen relacionado con un mayor riesgo de ictus e infarto de miocardio es el ALOX5AP71. El gen ALOX5AP codifica la proteína activadora de la 5-lipoxigenasa, esencial para la conversión del ácido araquidónico en leucotrieno A4, el cual ejerce un papel importante en la quimotaxis de leucocitos y la respuesta inflamatoria que desencadena la aterosclerosis.

Se están realizando estudios en los que se hace referencia al pronóstico del ictus y la respuesta farmacológica en relación con factores genéticos. Se ha encontrado que un polimorfismo en el gen que codifica el transportador del glutamato EAAT2 se relaciona con la presencia de deterioro neurológico72. La presencia de este polimorfismo se asocia con un aumento de la concentración plasmática de glutamato, con lo que se incrementa el daño debido a mecanismos de excitotoxicidad. Asimismo, se están realizando estudios farmacogenéticos en los cuales se investigan variaciones genéticas que determinen diferentes respuestas a fármacos, como los polimorfismos en los genes de la enzima microsomal hepática P450 2C9 (CYP2C9) o del complejo 1 vitamina K epoxido reductasa (VKORC1), que influyen en la sensibilidad a la warfarina73,74.

En resumen, se puede afirmar que en los últimos años asistimos a un incremento muy importante en la investigación básica de la enfermedad cerebrovascular. Los modelos animales confirman mecanismos patogénicos de la isquemia cerebral, aunque abren nuevas interrogantes y, por consiguiente, nuevas vías de investigación que ayuden a explicar un proceso tan complejo y heterogéneo como la isquemia cerebral. La investigación traslacional continúa siendo complicada y, por el momento, no logra completar las expectativas previstas. Es verdad que se ha recorrido mucho camino en la investigación de la isquemia cerebral, pero no es menos cierto que todavía queda mucho camino por recorrer en el excitante mundo de la investigación de la patología cerebrovascular.

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